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Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 2919 (2022) Citer cet article

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Les biocapteurs fluorescents génétiquement codés sont des outils puissants utilisés pour suivre les processus chimiques dans des systèmes biologiques intacts. Cependant, le développement et l’optimisation de biocapteurs restent un processus difficile et laborieux, principalement en raison des limites techniques des méthodes de criblage des biocapteurs candidats. Nous décrivons ici une modalité de dépistage qui combine la microfluidique des gouttelettes et l’imagerie automatisée par fluorescence pour fournir une augmentation d’un ordre de grandeur du débit de dépistage. De plus, contrairement aux techniques actuelles qui se limitent au dépistage d'une seule caractéristique du biocapteur à la fois (par exemple la luminosité), notre méthode permet d'évaluer plusieurs caractéristiques (par exemple le contraste, l'affinité, la spécificité) en parallèle. Les fonctionnalités des biocapteurs pouvant varier, cette capacité est essentielle pour une optimisation rapide. Nous utilisons ce système pour générer un biocapteur haute performance pour le lactate pouvant être utilisé pour quantifier les concentrations intracellulaires de lactate. Ce biocapteur, nommé LiLac, constitue une avancée significative dans la détection des métabolites et démontre la puissance de notre approche de criblage.

Les biocapteurs fluorescents génétiquement codés sont des outils importants pour étudier le métabolisme. Leur signal fluorescent offre une résolution temporelle élevée, à la fois sur des échelles de temps rapides et lors d'imagerie chronique1,2,3,4,5, et parce qu'ils sont génétiquement codés, ils peuvent être directement exprimés dans des cellules vivantes et ciblés sur des types de cellules et des organites spécifiques6,7. . Comme les cellules individuelles peuvent être métaboliquement distinctes et que les métabolites sont renouvelés à un rythme rapide8,9, les biocapteurs ont permis de manière unique de mesurer avec précision dans des cellules individuelles les états métaboliques de base et les perturbations métaboliques en réponse à un défi ou à un stimulus1,10.

Pour quantifier les concentrations de métabolites, la lecture d'un biocapteur fluorescent doit être i) adaptée aux concentrations physiologiques du ligand cible, ii) hautement spécifique pour ce ligand, et iii) robuste aux changements de l'environnement cellulaire (y compris le pH) et au niveau d'expression. du biocapteur lui-même. La seule façon de développer des biocapteurs aussi performants est de les cribler, en analysant de nombreuses variantes individuelles provenant de grandes bibliothèques de biocapteurs, car ils sont exposés à de nombreuses concentrations et conditions de ligands.

Cela pose un défi pour le criblage des biocapteurs. Malgré des progrès impressionnants dans l’ingénierie de nouvelles plates-formes pour l’évolution des protéines fluorescentes et des biocapteurs7,11,12,13,14, les écrans existants sont encore limités quant au nombre de conditions pouvant être testées par rapport au biocapteur. Ici, nous avons surmonté ces limitations, en augmentant le contenu et le débit de criblage de plusieurs ordres de grandeur, en combinant la microfluidique des gouttelettes et l'imagerie automatisée de la durée de vie de la fluorescence à deux photons (2p-FLIM). La durée de vie de la fluorescence est le temps moyen entre l'absorption et l'émission de photons, et les capteurs à durée de vie sont devenus des outils performants pour quantifier les niveaux de petites molécules dans les cellules intactes7,15,16. Ici, nous avons exploité des gels semi-perméables produits par microfluidique, appelés billes de gel (GSB)17, qui servent de chambres de dialyse à micro-échelle et les avons utilisés pour tester des milliers de variantes de capteurs à vie isolées indépendamment dans de nombreuses conditions différentes, en évaluant simultanément l'affinité, la spécificité et la réponse. taille.

Nous montrons également comment notre système de criblage, BeadScan, peut être utilisé pour développer et optimiser rapidement des biocapteurs fluorescents génétiquement codés. Pour démontrer les capacités de notre écran, nous avons utilisé BeadScan pour générer un capteur à vie haute performance pour le lactate, nommé LiLac. Le lactate est un produit clé de la glycolyse qui a récemment été apprécié comme un carburant cellulaire majeur circulant dans le sang, un moyen de communiquer l'état redox à travers les cellules et les tissus, et un carburant privilégié pour certains types de cancer18,19,20. Les biocapteurs de lactate existants ont été utilisés pour étudier le métabolisme dans le cerveau et dans les cellules cancéreuses21,22,23,24,25,26, mais chacun présente des limites qui rendent la quantification difficile (par exemple, une faible sensibilité aux changements physiologiques du lactate ou des réponses indésirables au calcium). et/ou pH). LiLac présente une grande taille de réponse (changement de vie de 1,2 ns et changement d'intensité > 40 % dans les cellules de mammifères), une spécificité pour le [lactate] physiologique et une résistance au calcium ou aux changements de pH. De plus, la réponse du LiLac à vie est très précise et ne nécessite pas de normalisation, ce qui facilite la quantification des concentrations de lactate dans les cellules vivantes. Ainsi, LiLac constitue un outil puissant pour étudier le métabolisme au niveau unicellulaire et démontre les avantages de notre approche de criblage.

80% efficiency) as they pass a localized field generated by an electrode (10 kHz, 0.5 kV), at which point the amplified DNA is captured by the beads. c Addition of perfluorooctanol (PFO) breaks the emulsion, which separates into an aqueous phase containing the beads and an oil phase. The beads are then washed to eliminate residual unbound DNA. d The library of DNA beads is re-encapsulated in new droplets along with in vitro transcription/translation (IVTT) reagents using a custom microfluidic device that combines the two aqueous streams immediately prior to emulsification, mitigating premature transcription and mRNA cross-contamination. Only droplets containing a DNA bead will express fluorescent biosensor protein following an overnight incubation at 30 °C. e Finally, IVTT droplets are converted into durable semipermeable GSBs by controlled microfluidic merging with a mixture of agarose (gel in sol) and alginate (polyanion), followed by emulsion breakage by PFO in the presence of PAH (polycation). The two polyelectrolytes form a semipermeable shell at the surface of the gel scaffold, trapping proteins and DNA inside the gel but allowing small molecules (<2 kDa) to pass through17. Continuous exchange of ligands allows for the collection of full dose-response curves from the biosensor protein encapsulated in each gel during downstream screening. Scale bars represent 20 μm./p>200,000 clonal copies of >2 kb amplicons, and millions of beads can be prepared in parallel. However, optimal expression of soluble sensor protein was achieved with beads intentionally limited to ~100,000 copies of DNA by pre-blocking a subset of streptavidin binding sites, because more densely loaded beads sometimes led to the accumulation of visible protein aggregates within the droplet (Suppl. Fig. 1c). We also optimized the concentration of biotinylated 3’ primer included in the emPCR droplets. We found that using an excess of biotinylated 3’ primer led to poor results, presumably because the unextended original biotinylated 3’ primer competes with fully-extended biotinylated DNA for streptavidin binding sites. Therefore, we used a limiting concentration of the 3’ primer to ensure the complete extension of all biotinylated primer molecules, so that only fully extended amplicons are captured on the streptavidin beads./p>20 mL/min flow rates within a standard microscopy perfusion chamber, allowing rapid exchange of external conditions while fluorescence responses from the encapsulated biosensors are recorded using 2p-FLIM. After screening, single GSBs are retrieved with a microcapillary and DNA sequences are recovered by PCR amplification and Sanger sequencing (Suppl. Fig. 3)./p>5-fold reduced variability, and substantially higher signal to noise ratio (LiLacSNR ~ 25, Laconicdonor lifetime,SNR < 1; Suppl. Fig. 6a–c). Here, the SNR metric estimates the change in lifetime signal in cells from 0 to 10 mM external lactate relative to the average noise level at each condition. We also observed that the lifetime of the Laconic donor species varies widely across cells bathed in lactate (Suppl. Fig. 6b–c), as also observed with its FRET signal23. By comparison, the high precision of the LiLac readout suggests that the cell-to-cell variability observed with Laconic may be an artifact of the biosensor. While the source of this variability is undetermined, recent evidence suggests that Laconic may be partially degraded in cells, producing some fluorescence signal that is uncoupled from lactate binding23./p>40% (Suppl. Fig. 7), which is comparable to that of the most sensitive intensity-based lactate biosensor23, but with the added benefit of substantial pH resistance. Therefore, LiLac can also be used as an intensiometric biosensor, although additional normalization would be required for the quantitative determination of lactate levels./p>200,000 clonal copies of >2 kb dsDNA per 6 μm bead. Existing methods that immobilize primers on a bead and then amplify from the bead surface (e.g. BEAMing) are limited to ~1000 copies/bead for comparably sized amplicons and beads27,28. We presume that molecular crowding constraints at the bead surface limit amplification efficiency, while our method circumvents this problem by allowing the template DNA to be amplified in free solution in the droplet before immobilization on beads. This advance combined with optimization of the reaction conditions within the droplets allowed us to achieve micromolar expression levels of unique biosensor protein variants in IVTT droplets and subsequent GSBs./p>

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